Ti6Al4V合金因具有優(yōu)異的力學和生物學特征而在骨植入物和骨組織修復領域備受關注 [1] 。但是，Ti6Al4V合金材料導熱系數(shù)小，彈性模量低，這使得傳統(tǒng)制造技術難以滿足復雜Ti6Al4V合金精密零件的制作要求 [2] 。隨著先進成型技術的快速發(fā)展，增材制造技術為上述問題提供了理想的解決途徑。激光粉末床融合技術（Laser Powder Bed Fusion, LPBF）具有加工分辨率高、設計靈活、成形穩(wěn)定、結果可預測等特點，是目前制造金屬部件最普遍采用的增材制造技術，能實現(xiàn)復雜多孔金屬材料的制備，可為患者提供“量體裁衣”式的骨科治療方案 [3] 。

鈦合金骨植入物的生物惰性是限制其臨床應用的主要因素 [4] ，因此應對其表面進行改性處理，以提高其生物活性，促進植入物與天然骨組織形成充分的骨整合 [5] 。鈦表面形貌可以通過多種改性方法改善 [5-10] ，目前廣泛采用的方法大致分為：物理處理法、化學處理法和生物處理法。其中，化學處理法操作簡單，易在材料表面形成均勻涂層，結構和成分與自然骨相似，并且對于多孔結構而言，化學處理可使涂層均勻覆蓋在復雜孔洞表面，是一種最適用的表面處理方法 [11] 。化學處理方法又包括酸蝕處理、堿熱處理、陽極氧化、微弧氧化等，是目前的研究熱點。本研究選用了經濟有效的堿熱處理方法，經堿熱處理后多孔鈦表面生成了一層具有生物活性的物質，再誘導類骨羥基磷灰石沉積，提高了惰性生物材料的生物活性，并且不損害材料本身的良好性能 [4,12-14] 。但是，以往的研究表明，在堿熱處理過程中，材料表面的鈦酸鈉納米線易聚集為片狀，分布不均且易產生裂紋，降低了表面改性產生的生物活化效率，這對后續(xù)羥基磷灰石沉積、細胞的粘附和增殖都將產生不良影響 [15] ，甚至會影響材料的整體力學性能。因此，探究合適的堿熱處理參數(shù)是提高經表面處理后材料生物活化效率的關鍵。

本研究通過優(yōu)化堿熱處理的工藝參數(shù)，在Ti6Al4V多孔鈦合金表面成功制備了分布均勻、大小適中且無裂紋的網狀納米結構涂層，并對此活化層的成分進行了分析；將表面改性后的樣品經模擬體液浸泡，使其表面形成多層次的納米結構涂層，并對樣品進行體外細胞實驗，考察其對成骨細胞粘附、增殖和分化過程的影響。

1 、實驗部分

1.1 樣品設計與制備

多孔鈦合金的單元結構特征和孔隙率參數(shù)是調節(jié)其力學和生物學性能的關鍵因素 [16] 。

因六方金剛石結構具有強度高、穩(wěn)定性強等性能特點 [17] ，在3-matic（Materialise）軟件中，以六方金剛石結構為基本重復單元，設計了小梁直徑為0.37 mm，孔隙率為70%的TiS圓柱（Φ 6 mm × 10 mm），模擬松質骨的孔隙度及幾何形狀特征。以Ti6Al4V合金粉末（粒徑15~53 μm）為原料，利用LPBF技術制備上述設計尺寸的Ti6Al4V多孔鈦合金試樣。打印參數(shù)：激光功率150 W，掃描速度1250 mm/s，鋪粉厚度0.03 mm，掃描間距0.05 mm。經準靜態(tài)壓縮實驗測試得知，所制備的多孔鈦合金樣品的彈性模量為2.815 GPa，抗壓強度為95.008 MPa，可滿足人骨對骨替換材料的力學要求。

1.2 表面處理與細胞活性測試

分別配制3 mol/L和7 mol/L的NaOH溶液，備用。燒杯中加入適量37% HCl溶液，將試樣完全浸潤其中，在水浴條件下50 ℃保溫60 min后取出，用大量去離子水和乙醇溶液超聲清洗、烘干。將試樣分別放入離心管中，加入適量3 mol/L或7 mol/L的NaOH溶液，水浴條件下60 ℃保溫1、4和10 h，具體實驗參數(shù)見表1。試樣取出后，用大量去離子水和乙醇溶液超聲清洗、烘干。最后，將試樣放入臥式爐中，通氬氣保護，在600 ℃下保溫30min，隨爐降溫后取出。采用掃描電子顯微鏡（SEM）和能量色散X射線光譜（EDS）表征樣品。另外，為了表征涂層，采用線切割將試樣軸向切開，使用SEM和EDS分析切面涂層。

選用最佳堿熱處理參數(shù)對樣品進行表面改性處理后，將樣品在37 ℃恒溫條件下置于模擬體液（SBF）中浸泡10 d（每48 h更換1次SBF），SBF成分如表1所示。取出浸泡后的試樣，放入烘干箱內70 ℃烘干24 h以上。為方便區(qū)分，對不同方式處理的試樣分別命名：將六方金剛石結構多孔鈦合金材料命名為TiS，將經過堿熱處理的六方金剛石結構多孔鈦合金材料命名為TiS-A，將經過堿熱處理并在模擬體液中浸泡10 d的六方金剛石結構多孔鈦合金材料命名為TiS-A SBF采用TiS、TiS-A和TiS-A SBF 這3組樣品，每組準備3件試樣進行細胞培養(yǎng)實驗。由于所設計的植入物主要針對骨創(chuàng)傷或疾病引起的骨缺損，因此選擇骨髓間充質干細胞（hBMSC）采用直接接觸的方式培養(yǎng)到樣品上。

按照iCell原代間充質干細胞無血清培養(yǎng)體系（PriMed-iCell-012-SF）配制，hBMSC細胞在5% CO₂ 、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為Control組和待測樣品組，其中，Control組每孔加入1000 μL 細胞懸液；待測樣品組先加入經過121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌處理20 min后的樣品，再在每孔加入1000 μL細胞懸液。每個處理組均做3個復孔。取對數(shù)生長期的hBMSC細胞進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度，采用直接接觸的方式，將hBMSC在48孔板鈦合金材料上接種2 × 10 4 個細胞，在5% CO₂、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗各孔3次，每孔加入1000 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基，再放入5% CO₂、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。最后采用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

細胞經48 h培養(yǎng)后，采用活細胞/死細胞染色試劑盒對樣品進行染色，評估細胞存活力：熒光染料鈣黃綠素（Calcein-AM）染色活細胞呈綠色，熒光染料PI（碘化丙啶）染色死細胞呈紅色。采用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察染色樣品。

2、 結果與討論

2.1 鈦合金表面處理后的微觀組織表征

酸蝕預處理能夠去除鈦合金表面的污染物和氧化層。堿熱處理過程中，通過HTiO₃^- 和HTiO ₃ ‒ •nH ₂ O吸引Na ⁺ 在表面生成網狀的鈦酸鈉凝膠層，再經高溫燒結，表面脫水形成鈦酸鈉。采用不同的實驗參數(shù)對鈦合金表面進行處理后，以電鏡觀察其微觀組織。如圖1所示，采用不同參數(shù)對鈦合金表面改性后，試樣表面均形成了納米線結構，并且未產生裂紋。當采用3 mol/L NaOH溶液時，在短時間內鈦合金表面呈現(xiàn)納米網狀結構，隨著時間延長，納米線直徑變粗并呈現(xiàn)團簇狀；NaOH濃度增至7 mol/L有利于鈦酸鈉納米線迅速生長及密度增大，隨著時間延長，鈦合金表面聚集為納米片狀結構，中心容易形成大的孔洞，分布不均勻。

對鈦合金表面形貌進行能譜分析，以 7 mol/L NaOH 溶液 60 ℃保溫 1 h 的處理方式為例，如圖 2 所示，試樣表面主要元素為 Na、O、Ti、Al、V。切割樣品對涂層進行電鏡觀察（圖 3），可見 Al和 V元素分布在整個涂層中并呈現(xiàn)出微小的波動，在邊界處 O元素出現(xiàn)明顯聚集。

綜上可知，采用高濃度堿溶液經短時間保溫處理的鈦合金試樣具有網狀結構有序、大小適中且分布均勻的表面形貌，可以為羥基磷灰石沉淀提供成核位點，促進細胞代謝過程的營養(yǎng)和氧氣交換，并為骨長入和骨整合提供適當?shù)目臻g [18] 。本研究表明多孔鈦合金經過酸洗預處理，用 7 mol/L NaOH溶液在 60 ℃下保溫 1 h 后，再經 600 ℃燒結 30 min 為最佳表面改性工藝，模擬體液浸泡實驗在此工藝下進行。

經過最佳表面改性工藝處理后，試樣經SBF培養(yǎng)10d，表面出現(xiàn)羥基磷灰石沉積涂層及白色花狀沉淀，如圖 4所示。

在模擬體液浸泡過程中，堿處理后鈦合金表面的 Na + 與 H ₃ O ⁺ 進行離子交換，使得鈦合金表面 pH 值增加，提高了 Ca ²⁺ 和 PO₄3‒ 活性，從而促進了磷灰石的形核；鈦合金表面形成了 Ti‒OH 官能團，能夠吸引模擬體液中的 Ca ²⁺ ，提高鈦和鈦合金表面的 Ca ²⁺ 和 PO₄3‒ 的過飽和度。堿處理后，鈦合金表面呈多孔網絡結構，TiO₂的密度增加，為磷灰石提供了優(yōu)越的異質形核位置，促使磷灰石從模擬體液中快速沉積出來而形成羥基磷灰石涂層。

2.2 多孔Ti6Al4V合金材料的生物學性能

為了評價多孔 Ti6Al4V 合金材料的生物相容性，從細胞形態(tài)和細胞相對活性兩個方面進行了考察。

采用直接接觸的方式將骨髓間充質干細胞在 TiS 上培養(yǎng) 48 h后的 CLSM結果如圖 5所示，Calcein-AM 可將活細胞染色而呈綠色、PI 可將死細胞染色而呈紅色（PI 染劑會被基體材料吸附）。實驗結果表明，經 48 h 培養(yǎng)后，實驗組與對照組的細胞均存活良好，僅有少量細胞死亡。相對于對照組細胞，實驗組細胞均勻分布在基體上，密度較高，但 Ti6Al4V合金材料的孔隙中不存在細胞，顯示出良好的貼壁細胞生長狀態(tài)。

在體外細胞培養(yǎng)過程中，鈦酸鈉納米線網狀結構可促進初始細胞粘附和營養(yǎng)供應，有利于早期骨再生。堿處理后的多孔 Ti6Al4V 合金經過模擬體液浸泡后，表面形成的磷灰石層是一種典型的生物活性材料，可與周圍骨組織發(fā)生化學鍵合，進一步提高其生物活性。

CCK8測試法是一種可用于細胞增殖和毒性分析等方面的生物測試方法。本研究采用CCK-8測定法評估細胞增殖。根據式（1）計算各組實驗試樣的細胞相對活性(Cell Vitality)。

式（1）中：OD e 為實驗組 OD 值，OD b 為背景 OD 值，OD c 為對照組 OD 值，OD = lg（1/trans）。其中，OD b 為多孔板本身（未加培養(yǎng)基和細胞的孔）的吸光度。

由圖 6 可見，TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的細胞相對活力分別為 50.91%、52.47%、58.53%，Ti6Al4V 合金具有優(yōu)良的生物相容性，表面改性處理生成了鈦酸鈉納米線層，有助于提高材料生物活性；表面再經模擬體液浸泡，生物活性進一步提高，細胞相對活性由未處理前的 50.91%提高至 58.53%。

在體外細胞培養(yǎng)過程中，鈦酸鈉納米線網狀結構可促進初始細胞粘附和營養(yǎng)供應，有利于早期骨再生。堿處理后的多孔 Ti6Al4V 合金經過模擬體液浸泡后，表面形成的磷灰石層是一種典型的生物活性材料，可與周圍骨組織發(fā)生化學鍵合，進一步提高其生物活性。

3、 結論

對多孔 Ti6Al4V 合金的最佳堿熱處理工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，并通過體外細胞培養(yǎng)實驗驗證了 TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的生物學性能，得到如下結論：

1）堿熱處理過程采用較低濃度堿溶液時，鈦合金表面在短時間內呈現(xiàn)納米網狀結構，隨著時間延長，納米線直徑變粗呈現(xiàn)團簇狀；采用較高濃度堿溶液時，有利于鈦酸鈉納米線迅速生長及密度增大，隨著時間延長，鈦酸鈉納米線聚集為納米片狀結構，中心容易形成大的孔洞，分布不均勻。

2）多孔 Ti6Al4V 合金本身具較好的生物學性能，經堿熱處理后，表面形成鈦酸鈉納米線涂層，細胞相對活性由 50.91%提高至 52.47%；再將堿熱處理后的 Ti6Al4V 合金材料浸入 SBF 溶液中浸泡 10 d，表面會生成磷灰石涂層，此時的細胞相對活性提高至 58.53%。

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